Em artigo publicado no FASEB Journal, pesquisadores do CEPID Redoxoma liderados pela professora Alicia Kowaltowski, do Instituto de Química da USP, demostraram que o transportador responsável pelo efluxo de íons de cálcio das mitocôndria, o NCLX, é um importante nó regulador que integra mitocôndrias, controle de autofagia por íons de cálcio e respostas celulares à disponibilidade de nutrientes. Com isso, eles estabeleceram a ligação entre a autofagia e o cálcio mitocondrial, dois processos fundamentais na regulação do metabolismo energético.

“Essa trabalho é importante porque fizemos o link entre esses processos. Como tanto a mitocôndria quanto a autofagia estão envolvidas no metabolismo, faz sentido que exista uma coordenação entre elas. Normalmente quando a gente estuda biologia celular, as coisas são vistas separadas e precisamos lembrar que, nas células, um processo depende do outro, regula o outro. E apesar de ser um trabalho de ciência básica, que parece meio abstrato, esse conhecimento com certeza pode ser usado em contextos patológicos para o desenvolvimento de alvos terapêuticos”, afirmou Vitor de Miranda Ramos, que propôs investigar a ligação entre esses processos durante seu doutorado e é o primeiro autor do artigo.

Além de gerarem energia para as células, as mitocôndrias participam diretamente de diversas de vias de regulação celular sensíveis ao cálcio, pois são capazes de captar, absorver e liberar íons de cálcio. A captação mitocondrial de íons de cálcio é mediada pelo complexo uniporter mitocondrial de cálcio (MCU), enquanto o trocador mitocondrial Na⁺/Li⁺/Ca²⁺ (NCLX), move íons de cálcio da matriz mitocondrial para o espaço entre a membrana interna e a externa, em troca de íons de sódio.

O cálcio afeta quase todos os aspectos da vida celular. Íons de cálcio são segundos mensageiros conhecidos na sinalização metabólica e desempenham um papel importante na regulação da autofagia.

Autofagia

A autofagia é um processo evolutivamente conservado de degradação e reciclagem de componentes celulares, tendo o papel basal de manutenção da homeostase celular. Por sua habilidade em remover elementos indesejados e promover a disponibilidade de nutrientes, a autofagia é necessária para controle de qualidade, renovação tecidual e regulação metabólica.

Além da função basal, a autofagia também é ativada em resposta à diminuição da disponibilidade de nutrientes, sendo considerada como um dos mecanismos responsáveis pelos benefícios da restrição calórica. Em trabalho anterior com animais em restrição calórica, o grupo de Kowaltowski já havia constatado que variações na dieta afetavam os transportadores mitocondriais de cálcio.

Neste trabalho, como ponto de partida para entender a interação entre o transporte mitocondrial de cálcio e a autofagia, os pesquisadores submeteram camundongos a quatro meses de restrição calórica e observaram que as mitocôndrias isoladas do fígado desses animais continham níveis mais elevados de NCLX do que as dos animais submetidos a uma dieta ad libitum.

A partir disso, usando células de fígado em cultura, criaram modelos para mimetizar a restrição calórica e novamente observaram o aumento da expressão de NCLX.

Em paralelo, eles investigaram o que acontecia com células em que havia menos NCLX. Para isso, em um experimento diminuíram a expressão da proteína usando a técnica de knockdown genético (KD) de NCLX por transfecção de pequenos RNAs de interferência (siRNA) e em outro provocaram a inibição aguda da atividade do NCLX por meio farmacológico. Em ambos os casos os pesquisadores viram que a diminuição do NCLX prejudica tanto a autofagia basal quanto a induzida pela falta de nutrientes.

Segundo Kowaltowski, nem todos os processos que regulam a autofagia descritos na literatura afetam a autofagia basal. “O fato de alterar a autofagia basal é bem significativo, mostra que o NCLX é mesmo um regulador importante na célula.“

Inibição do transportador de cálcio mitocondrial, NCLX, compromete autofagia em células. As imagens mostram a marcação de organelas responsáveis pelo processo de degradação autofágica em células, os autofagosomos (em amarelo) e sua forma madura, os autolisosomos (em vermelho). Podemos ver que a célula com menos NCLX (direita) possui menos marcação do que uma célula normal (esquerda), demonstrando falha na formação destas organelas. – Vitor de Miranda Ramos.

Mecanismo

A partir de diferentes medidas realizadas em várias etapas do processo de autofagia, os pesquisadores descobriram que a atividade do NCLX afeta os passos iniciais da maquinaria autofágica. Na autofagia, componentes celulares são sequestrados por autofagossomos, que por sua vez se fundem com lisossomos para promover a digestão de organelas ou proteínas. Com os dados obtidos neste estudo, os pesquisadores concluíram que a alteração do cálcio intracelular resultante da inativação do NCLX interfere na formação do autofagossomo, prejudicando as etapas iniciais da autofagia.

Diferente do que seria esperado, os pesquisadores também viram que a inibição do NCLX não alterou a produção de ATP nas mitocôndrias, nem afetou a via da proteína quinase ativada por AMP (AMPK), que é ativada quando a energia está baixa na célula. “Na verdade, essa regulação da autofagia pelo NCLX está acontecendo pelo cálcio celular independente dessa via”, conclui Kowaltowski.

A produção de energia da célula está muito ligada com a autofagia. A falta de energia provoca a autofagia, que libera nutrientes que a célula consegue usar naquela situação emergencial. Em 2023, o grupo de Kowaltowski publicou um artigo mostrando que existe uma faixa ideal de cálcio em que a respiração mitocondrial, e portanto a produção de energia, é ativada. Embora a inibição do NCLX tenha alterado a concentração de cálcio da célula de forma suficiente para afetar a autofagia, o nível de cálcio mitocondrial não saiu da faixa ideal.

Segundo os pesquisadores, mais estudos são necessários para elucidar os complexos mecanismos de controle da autofagia pelo cálcio citoplasmático. “Obviamente, a sinalização do cálcio é muito complexa, talvez promíscua na célula, pois muitas proteínas podem se ligar ao cálcio e ser reguladas por ele, então é difícil chegar a um mecanismo específico”, afirmou Ramos.

O pesquisador realizou parte do estudo com uma Bolsa Estágio de Pesquisa no Exterior (BEPE) da FAPESP, no laboratório do professor Viktor I. Korolchuk, da Newcastle University, na Inglaterra. “Eles têm expertise em autofagia e trouxeram várias ferramentas para fazer diferentes medidas e ver diferentes aspectos da autofagia”.

NCLX

O gene que codifica o transportador NCXL, uma proteína mitocondrial, foi identificado em 2010. Desde então, segundo os pesquisadores, vários estudos revelaram importantes funções fisiológicas do NCLX promovidas pela formação de sinais de cálcio, incluindo a regulação da secreção de insulina, autoestimulação da célula muscular cardíaca e a secreção de lactato e glutamato nos astrócitos.

A diminuição da expressão de NCLX foi observada em algumas patologias, como na doença de Alzheimer e em Parkinson. “Já foi visto que pacientes que morreram com a doença de Alzheimer tinham menos NCLX. Em modelos animais, quando os pesquisadores revertem para níveis de NCLX normais, eles conseguem melhorar o fenótipo da doença”, diz Ramos

O cérebro usa muita energia e precisa de muitas mitocôndrias. O acúmulo de danos nas células pode levar à morte celular e ao desenvolvimento dessas patologias. “Apesar de não termos olhado especificamente para contextos patológicos, esse link entre a sinalização de cálcio e a autofagia é interessante porque pode ser uma ideia de progressão em alguma doença. Ao perder a atividade desse transportador, mais danos são gerados, e o processo para limpar esses danos - a autofagia - está prejudicado. Isso abre perspectivas para trabalhos futuros,” afirmou Kowaltowski.

O artigo Mitochondrial Sodium/Calcium Exchanger (NCLX) Regulates Basal and Starvation-Induced Autophagy Through Calcium Signaling, de Vitor de Miranda Ramos, Julian D.C. Serna, Eloisa A. Vilas-Boas, João Victor Cabral-Costa, Fernanda M. da Cunha, Tetsushi Kataura, Viktor I. Korolchuk e Alicia J. Kowaltowski, pode ser lido aqui.