Depois de múltiplas investigações, que incluíram extensos levantamentos em diversos bancos de dados genômicos, pesquisadores do CEPID Redoxoma liderados pelo professor Francisco Laurindo, do Instituto do Coração da Faculdade de Medicina da USP, mostraram que os genes que codificam a proteína dissulfeto isomerase (PDIA1) humana e seus parálogos PDIA2 e PDIA8 são flanqueados por genes que codificam as RhoGDIs, que são reguladores das RhoGTPases e do citoesqueleto. PDIs são essenciais ao enovelamento redox de proteínas no retículo endoplasmático e têm vários efeitos em vias redox de sinalização. Estudando a história evolutiva dos genes, mostraram que eles compartilham o mesmo locus gênico desde o último ancestral comum dos animais vertebrados, sendo que o arranjo estrutural primordial entre uma PDI e uma RhoGDI é ainda mais antigo e pode ser encontrado no último ancestral comum entre cnidários e animais bilaterais, há cerca de 820 milhões de anos. O trabalho foi publicado na revista Science Reports, do grupo Nature.

“Esses dados sugeriram fortemente que existe uma relação funcional entre as duas famílias de proteínas, considerando principalmente a impressionante conservação do arranjo gênico. Todos os vertebrados e até alguns invertebrados apresentam esses pares de genes em microsintenia (i.e., o posicionamento dos dois genes de modo muito próximo). Distinguimos um par microsintênico de uma PDI e uma RhoGDI em cnidários, que são animais bastante ancestrais na escala biológica, e até nos primitivos placozoários. Isso indica uma pressão seletiva muito forte para manter essa ordem dos genes”, afirmou Laurindo.

Para estudar a história evolutiva da sintenia entre as proteínas, os pesquisadores examinaram na rede mais de cinco mil sequências de DNA e buscaram todas as espécies que apresentavam os pares sintênicos PDIA1/ RhoGDIα, PDIA2/RhoGDIγ e PDIA8/RhoGDIβ, como explicou a pós-doutora e bióloga Ana Moretti, primeira autora do artigo. O levantamento inicial dos dados foi feito durante o doutorado de Jessyca Pavanelli, co-primeira autora do artigo.

Com os dados, eles elaboraram, juntamente com vários colaboradores, uma árvore evolutiva e traçaram a trajetória dos genes através da filogenia animal. Constataram, assim, que a emergência do grupo de genes data do último ancestral comum entre cnidários e animais bilaterais. O par de genes original sofreu duas duplicações sucessivas no último ancestral comum dos vertebrados, que deram origem aos três pares de genes contemporâneos (PDIA1/RhoGDIα, PDIA2/RhoGDIγ e PDIA8/RhoGDIβ), que se mantiveram juntos.

Alguns peixes ancestrais, como o spotted gar, originário da bacia do Mississipi, nos Estados Unidos, cujo genoma precedeu a duplicação ocorrida nos peixes teleósteos, e o celacanto, considerado um fóssil vivo precursor dos tetrápodos terrestres, apresentam um padrão de arranjos gênicos muito semelhante ao de vertebrados. No entanto, ao analisarem o mapa evolutivo em peixes, os pesquisadores perceberam que, com a duplicação do genoma, vários deles (por exemplo, o peixe-zebra) perderam esta microsintenia.

Nesta etapa da pesquisa, salienta Laurindo, foram importantes as colaborações do grupo com Diego Bonatto, da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, e Ingo Ebersberger e Ralf Brandes, da Goethe University, em Frankfurt, Alemanha.

Investigação funcional

Para determinar se a sintenia compartilhada entre genes da PDI e da RhoGDI está associada a conexões funcionais entre essas duas famílias, os pesquisadores procuraram sua co-expressão e co-regulação em resposta a várias intervenções.

A análise de bancos públicos de dados de sequencias de RNA, estudo feito com grupo de Matthias Leisegang e Ralf Brandes, também da Goethe University, mostrou que “em situações de desenvolvimento e maturação, principalmente de células tronco, há uma co-regulação, ou seja, os genes da PDI e da RhoGDI realizam a transcrição do DNA ao mesmo tempo, sugerindo que um dos contextos potenciais em que a co-regulação ocorre e é conservada é durante fenômenos de desenvolvimento e, talvez, de diferenciação celular”, explicou Laurindo.

Depois, eles investigaram o padrão da co-regulação em diversos modelos. Segundo Moretti, os estudos mostraram que os genes da PDI e da RhoGDI têm co-regulação em situações específicas, ou seja, quando os pesquisadores afetam a expressão de um deles, conseguem regular o outro, positiva ou negativamente. Mas a co-regulação dos genes só acontece quando um deles é ativado transcricionalmente e não quando apenas a expressão da proteína é induzida. “Para que ocorra a co-regulação, é necessário algum estímulo, pode ser o soro, no caso das culturas de células, ou uma lesão vascular, quando, de alguma forma, você está ativando a transcrição desses genes”.

Por exemplo, em testes realizados em órgãos de camundongos transgênicos que superexpressam a PDI, os pesquisadores viram que, sem nenhum estímulo, simplesmente ter a expressão aumentada da PDI não leva a um aumento da expressão da RhoGDI. No entanto, foi possível identificar algum grau de co-regulação quando usaram a tecnologia do CRISP-R para forçar a transcrição dos genes da PDI e da RhoGDI. Diferente do CRISP-R usado para deletar um gene, os pesquisadores usaram uma CRISP-R Cas9 mutada, a CRISPRa dCas9 VP64, na qual foi inserida uma sequência de nucleotídeos guia que a levava até a região promotora por eles desenhada, que, então, era ativada. Ao ativar a região promotora da RhoGDI, dependendo da região promotora da ativada, eles conseguiram ver a expressão aumentada da PDI e da RhoGDI e o mesmo aconteceu quando ativaram a região promotora da PDI.

A co-regulação também foi observada na camada íntima arterial de camundongos durante remodelamento vascular induzido por fluxo, que também é uma situação em que ocorre extensa transcrição de genes associados à resposta de reparação tecidual e inflamação. E, por fim, em ensaios de co-imunoprecipitação e ligação por proximidade, eles verificaram que as duas proteínas se associam fisicamente em células endoteliais, reforçando a ideia de uma ligação funcional entre elas.

Segundo os pesquisadores, os dados funcionais somados ao padrão altamente conservado de microsintenia dos genes da PDI e da RhoGDI e sua história evolutiva apontam para uma conexão entre estas duas famílias de proteínas, que são altamente expressas e têm alta relevância funcional. Esta conexão deverá ajudar a entender o papel da RhoGDIα e das RhoGTPases na regulação da arquitetura do citoesqueleto mediada pela PDIA1, descrita anteriormente pelo grupo.

PDIs, RhoGDIs e citoesqueleto

O citoesqueleto é responsável pela manutenção da estrutura e da organização interna das células, permitindo que elas exerçam funções essenciais, como divisão celular e movimento.

Dentre as proteínas que atuam sobre o citoesqueleto, estão as RhoGTPases, interruptores moleculares de sinalização, que regulam o movimento celular, a migração, a adesão celular e a diferenciação. Existem entre 17 e 20 RhoGTPases diferentes, associadas a várias dezenas de reguladores específicos (conhecidos como GEFs e GAPs) nas células. Na membrana plasmática, elas ativam cascatas de sinalização, com funções na organização do citoesqueleto celular durante o movimento. Elas atuam como se fossem uma chave que liga e desliga vários alvos, como, por exemplo, proteínas ligadas à montagem do citoesqueleto, à fagocitose ou à curvatura da membrana.

Além dos GEFs e GAPs, RhoGTPases são reguladas pelas RhoGDIs, que determinam o local de ativação dessas RhoGTPases e seu ciclo subcelular. Ou seja, explica Moretti, “sem a RhoGDI, a RhoGTPase perde a direcionalidade”. Em um exemplo interessante, os pesquisadores lembram um trabalho feito com plantas, mostrando que, quando os genes da RhoGDI são nocauteados, a raiz deixa de crescer na direção certa.

A PDI é uma proteína bastante versátil. Ela é uma chaperona do retículo endoplasmático (RE) pertencente à superfamília da tiorredoxina, com importante atividade na sinalização e homeostase redox, cuja função mais conhecida é seu papel no enovelamento redox de proteínas.

A relação da PDI com a RhoGDI vem sendo estudada há muitos anos pelo grupo de Laurindo, que já encontrou evidências de que a PDIA1, o protótipo da família das PDIs, está envolvida na regulação fina do citoesqueleto, com papel na ativação da NADPH oxidase dependente de fatores de crescimento na célula.

Em 2012 o grupo publicou um artigo no Journal of Biological Chemistry (JBC) com resultados da análise de redes de interação proteína-proteína, usando Biologia de Sistemas, em que identificaram in silico uma possível convergência entre a PDI e as RhoGTPases e seu regulador RhoGDI. Como uma das RhoGTPases é a Rac1, que é um componente da NADPH oxidase, essa poderia ser uma das vias de ação da PDI. “Já naquela época começamos a ver muitos efeitos da PDI no citoesqueleto, o que era algo inesperado, e começamos a suspeitar que havia uma interação entre a PDI e a RhoGDI”, afirmou Laurindo.

No entanto, segundo os pesquisadores, a natureza da interação entre a PDIA1 e a RhoGDIα ainda é desconhecida e sua associação não é óbvia, tendo em vista suas distintas posições e funções subcelulares. O estudo evolutivo dos grupos de genes em microsintenia é uma maneira nova de tentar estabelecer vínculos mecanicistas plausíveis entre PDIA1, a regulação do citoesqueleto e as RhoGDI/RhoGTPases, na medida em que grupos de genes preservados na evolução parecem ter interação funcional e co-regulação. Afinal, diz Laurindo, “820 milhões de anos de convivência devem ter algum significado”.

O artigo Conserved Gene Microsynteny Unveils Functional Interaction Between Protein Disulfide Isomerase and Rho Guanine-Dissociation Inhibitor Families, de Ana I. S. Moretti, Jessyca C. Pavanelli, Patrícia Nolasco, Matthias S. Leisegang, Leonardo Y. Tanaka, Carolina G. Fernandes, João Wosniak Jr, Daniela Kajihara, Matheus H. Dias, Denise C. Fernandes, Hanjoong Jo, Ngoc-Vinh Tran, Ingo Ebersberger, Ralf P. Brandes, Diego Bonatto e Francisco R. M. Laurindo, pode ser lido em https://www.nature.com/articles/s41598-017-16947-5