Nosso cérebro é rico em lipídios. Encontradas em grande quantidade e ampla variedade no sistema nervoso central (SNC), essas moléculas hidrofóbicas controlam a fluidez das membranas celulares e formam a bainha de mielina, facilitando a transmissão de impulsos elétricos, além de participarem da sinalização celular. Lipídios encontrados no SNC são bastante poli-insaturados e, portanto, suscetíveis a oxidações tanto enzimáticas quanto por espécies reativas de oxigênio. Alterações do metabolismo lipídico em neurônios e em células da glia modulam processos ligados ao envelhecimento e a doenças neurodegenerativas.

Para investigar a relação entre alterações lipídicas no SNC e a esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença fatal caracterizada pela perda progressiva de neurônios motores, pesquisadores do CEPID Redoxoma liderados pela professora Sayuri Miyamoto, do Instituto de Química da USP, realizaram uma análise lipidômica comparativa de tecidos do córtex motor e da medula espinhal de um modelo animal de ELA e mostraram que o metabolismo lipídico está alterado nos animais sintomáticos, com acúmulo de ésteres de colesterol e diminuição dos níveis de cardiolipina na medula espinhal como principais assinaturas lipídicas da doença.

Os resultados do estudo sugerem a presença de mitocôndrias disfuncionais nos neurônios motores e o acúmulo de gotículas lipídicas em astrócitos aberrantes. Com base nisso, os pesquisadores formularam a hipótese de que ésteres de colesterol sejam sintetizados em excesso nos neurônios, acumulando-se posteriormente na forma esterificada nos astrócitos, como um mecanismo de neuroproteção contra o estresse oxidativo. Os resultados do trabalho foram publicados na revista Scientific Reports.

“Nosso trabalho confirma dados da literatura que mostraram o aumento de ésteres de colesterol em ELA, mas agora com uma ferramenta mais poderosa no sentido de fazer uma caracterização de todo lipidoma de tecidos do córtex motor e da medula espinhal de um modelo animal da doença. Nós caracterizamos cerca de dez ésteres de colesterol e todos eles poli-insaturados. O aumento de ésteres de colesterol também já foi demonstrado na doença de Alzheimer. Estamos propondo um mecanismo com base nesses achados que talvez seja comum a várias doenças neurodegenerativas”, afirmou Miyamoto.

Ésteres de colesterol no SNC

Os ratos SOD1- G93A utilizados neste estudo são animais transgênicos que superexpressam o gene da enzima Cu/Zn-superóxido dismutase humana e desenvolvem esclerose lateral amiotrófica. Os pesquisadores analisaram tecidos do córtex motor e da medula espinhal desses animais em duas fases: aos 70 dias de vida, quando ainda estão assintomáticos, e aos 120 dias, quando já apresentam os sintomas da doença. Como controle, foram analisados tecidos de animais do tipo selvagem (WT), ou seja, sem a mutação, nas mesmas idades.

No córtex motor, foram identificadas e quantificadas 285 espécies de lipídios, classificadas em 26 subclasses. Nos ratos mais velhos (SOD1-G93A 120d e WT 120d), os pesquisadores encontraram um aumento de esfingolipídios, que são componentes da bainha de mielina e estão associados à idade dos animais. Aos 120 dias, os ratos são adultos jovens – a expectativa de vida deles é de dois a três anos – e ainda estão em um estágio de desenvolvimento neuronal, que é acompanhado do aumento na concentração de esfingolipídios.

Os resultados mais interessantes foram encontrados na medula espinhal, onde identificaram e quantificaram 406 espécies de lipídios, classificadas em 33 subclasses. Em comparação tanto com os animais controle quanto com os assintomáticos, os ratos sintomáticos têm níveis seis vezes maiores de lipídios de reserva, os ésteres de colesterol, e uma significativa diminuição nas concentrações de cardiolipina.

Ésteres de colesterol se acumulam devido à síntese aumentada de colesterol induzida por um desequilíbrio do estado redox celular, envolvendo, entre outros fatores, a disfunção mitocondrial, que leva a uma maior produção de espécies reativas de oxigênio. No estudo, a disfunção mitocondrial foi evidenciada pela diminuição do conteúdo de cardiolipina, que é um lipídio encontrado na membrana interna das mitocôndrias, tendo papel importante na estrutura e na função das organelas. O comprometimento do metabolismo energético tem sido observado em pacientes e em modelos animais de ELA. A geração de espécies reativas de oxigênio, a agregação de proteínas e a disfunção mitocondrial em neurônios motores são marcas registradas da doença

O acúmulo de lipídios de reserva na medula espinhal do mesmo modelo animal de ELA já havia sido evidenciado em outros estudos pelo isolamento de astrócitos com características aberrantes contendo abundantes gotículas lipídicas, cujo conteúdo não foi caracterizado.

“A síntese de lipídeos de reserva está associada a mecanismos de sobrevivência e proteção celular. Em geral, células submetidas a condições de estresse acumulam lipídeos de reserva. Mas pouco se sabe sobre a composição química das gotículas lipídicas. Acredita-se que as gotículas sejam constituídas predominantemente por triacilgliceróis, conhecidos popularmente como gordura, que é a forma mais comum de armazenamento de energia, e que são encontrados em abundância no tecido adiposo. Não é comum a célula armazenar ácidos graxos na forma de ésteres de colesterol”, explica Adriano Britto Chaves-Filho, um dos primeiros autores do trabalho. A função atribuída para os ésteres de colesterol circulantes é de transporte de colesterol. No sistema nervoso central, a função desses lipídios é pouco conhecida.

Os pesquisadores agora propõem que ésteres de colesterol sejam os principais componentes das gotículas lipídicas em astrócitos aberrantes. De acordo com modelo proposto neste trabalho, com a progressão da doença, a presença de mitocôndrias disfuncionais nos neurônios e o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio seriam um gatilho para a formação dessas gotículas.

Segundo os pesquisadores, a análise precisa de espécies de lipídios pode ajudar a explorar ainda mais o papel do estresse oxidativo na regulação do metabolismo lipídico em doenças neurodegenerativas e no envelhecimento.

Lipidômica

A lipidômica é uma área de estudos emergente quando comparada a outras ômicas, como proteômica, genômica e transcriptômica. E quer dizer a análise global de todos os tipos de lipídios existentes em sistemas biológicos. Caracterizar e quantificar lipidomas - o conjunto de lipídios de uma célula - é uma tarefa complexa, pois os lipídios apresentam uma grande diversidade na estrutura química e possuem propriedades distintas. Atualmente, existem cerca de 43 mil estruturas lipídicas únicas anotadas no Lipid Maps Structure Database, que é o maior banco de dados público de lipídios do mundo.

O avanço da técnica de espectrometria de massas, com a descoberta de fontes de ionização brandas, permitiu a análise de biomoléculas e, com isso, fez avançar a lipidômica. “Com a ionização branda, conseguimos converter moléculas da fase líquida para fase gasosa sem quebrá-las”, explica a pesquisadora. A espectrometria de massas é o processo de ionizar uma amostra, separar os íons por massa e carga, detectar os íons e registrar um espectro.

Além do avanço na ionização, surgiram também espectrômetros de massas alta resolução, como o que foi adquirido pelo CEPID Redoxoma em 2016, que, além de dar precisão na determinação estrutural de moléculas, tem uma velocidade alta de aquisição. “Esse equipamento nos permite adquirir vários espectros de íons intactos e fragmentados, a partir dos quais podemos fazer análises lipidômicas qualitativas e quantitativas. E, no nosso laboratório, o pos-doc Marcos Yukio Yoshinaga trouxe o know-how para interpretar os espectros de massa e identificar os lipídios”, afirma a pesquisadora.

Os softwares para análises lipidômicas ainda produzem resultados imprecisos, com erros na identificação de lipídios, por isso, neste estudo os pesquisadores fizeram a identificação manual dos lipídios. Segundo Miyamoto, “todos os lipídios identificados passaram por uma rigorosa caracterização molecular, além dos padrões internos que usamos para garantir uma quantificação mais precisa. Assim, os dados que geramos são bastante robustos”.

O artigo Alterations in lipid metabolism of spinal cord linked to amyotrophic lateral sclerosis, de Adriano Britto Chaves-Filho, Isabella Fernanda Dantas Pinto, Lucas Souza Dantas, Andre Machado Xavier, Alex Inague, Rodrigo Lucas Faria, Marisa H. G. Medeiros, Isaias Glezer, Marcos Yukio Yoshinaga e Sayuri Miyamoto, pode ser lido em https://www.nature.com/articles/s41598-019-48059-7